| |||
![]()
|
![]() ![]() |
![]()
всё неймётся, оленевод? ДНК спермы лосося (точнее, не из спермы, а из молок, если по-русски) используется при гибридизации для связывания с потенциальными неспецифическими мишенями, чтобы потом зонд на них не лип. Блот-гибридизация ДНК Материалы • Предгибридизационный буфер: 5 х SSPE, 5 х раствор Денхардта, денатурированная и обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося, 100 мкг/мл, 0,1% (о/о)ДСН. При работе с найлоновыми фильтрами концентрацию ДСН необходимо увеличить • Гибридизационная смесь: 5 х SSPE, 5 х раствор Денхардта, денатурированная и обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося, 100 мкг/мл, 0,1% (о/о) ДСН, 10% декстрансульфат, денатурированный меченый зонд0. При работе с найлоновыми фильтрами концентрацию ДСН необходимо увеличить до 1% (о/о). • Буфер для отмывания 1: 2 х SSC, 0,1 % ДСН • Буфер для отмывания 2: 0,25 х SSC, 0,1 % ДСН • 20 x SSC • 20 х SSPE: 3 М NaCl, 0,3 М фосфат натрия, 40 мМ ЭДТА, рН 7,2 • 100 х раствор Денхардта: 2% (в/о) БСА, 2% (в/о) фиколл-400, 2% (в/о) поливинилпирролидон-360 Методика 1. Замачивают фильтр с иммобилизованной ДНК в воде и помешают его в пластиковый пакет. 2. Добавляют предгибридизационный буфер (из расчета 10 мл буфера на 100 см2 фильтра), удаляют из пакета все пузырьки воздуха и запаивают его. Помешают пакет между двумя стеклами и проводят предгибридизацию при 65 °С в течение 2-4 ч. 3. Срезают один из углов пакета, сливают буфер. 4. Добавляют в пакет с фильтром гибридизационный буфер, содержащий денатурированный зонд (из расчета 4 мл буфера на 100 см2 фильтра). Для денатурации зонд можно прогреть в кипящей воде в течение 10 мин. 5. Выдавливают из пакета все пузырьки воздуха и снова его запаивают. Помешают пакет между двумя стеклами и проводят гибридизацию при 65 °С в течение 16 ч. 6. Осторожно, чтобы не повредить фильтр, вскрывают пакет и сливают гибридизационную смесь. Эту смесь можно использовать повторно. Если зонд помечен радиоактивным изотопом, следует обеспечить его безопасное хранение и правильное захоронение радиоактивных отходов. 7. Несколько раз ополаскивают фильтр в буфере для отмывания 1 и выдерживают в трех сменах того же буфера при комнатной температуре, по 5 мин в каждой смене. 8. Промывают фильтр при комнатной температуре в трех сменах буфера для отмывания 2, по 5 мин в каждой смене. 9. Промывают фильтр при температуре 55—65 С в трех сменах буфера для отмывания 2, по 30 мин в каждой смене. 10. Аккуратно промокают фильтр и заворачивают его в пластиковую пленку. 11. При работе с изотопно меченными зондами проводят радиоавтографию в специальной кассете. Снизу в кассету помещают усиливающий экран, на него кладут рентгеновскую пленку и сверху помещают фильтр так, чтобы сторона с ДНК была обращена к пленке. Если используются нерадиоактивно меченные зонды, то фильтры обрабатывают блокирующими агентами, чтобы предотвратить фоновое окрашивание при обработке фильтра детектирующими реактивами. Фильтр можно хранить во влажном состоянии при 4 °С. 12. Изотопно меченные зонды должны иметь удельную радиоактивность ~ 10 имп./мин на 1 мкг. Обычно достаточно, чтобы радиоактивность гибридизационной смеси составляла 106—107 имп./мин на 1 мл. Кинетика реассоциации нерадиоактивно меченных зондов немного отличается от таковой для Р-зондов, и для достижения оптимальной чувствительности необходима более высокая концентрация зонда. Эту концентрацию можно рассчитать по следующей формуле: А = В/50*1/С*16/Д, где А — необходимая концентрация зонда (мкг/мл) В — «сложность» зонда С — концентрация декстрансульфата (в %) D — время гибридизации (ч) Концентрация зондов, полученных методом ник-трансляции, обычно составляет 50-100 нг/мл. - Для предотвращения утечки изотопно меченных зондов гибридизационный пакет помещают во второй запаянный пакет. - Жесткость условий, при которых проводятся последние отмывания, можно повысить, уменьшив концентрацию SSC (до 0,1 x вместо 0,25 х). Это обычно не сопровождается снижением чувствительности. Добавить комментарий: |
|||
![]() |
![]() |