ЖАДНО, ЖАДНО ХОЧУ!
(и про секрет CXCR5 тоже хочу, если отдашь :) чисто из профессионального любопытства, я сама никогда не сталкивалась с этой проблемой но посмотреть могу...

(Reply to this) (Thread)

(у меня, конечно, есть куча идей, как можно повозиться с такой дурной прокраской... но эти перцы из ПНАС либо не заморочились, либо там все хитро)

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Там все надо слегка через одно место, чтоб работало. Фиксатор от одной компании с протоколом от фиксатора другой и никак иначе. ;) Ну это часть.

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Через мои руки прошло много разных GFP+ клеток, и они внезапно очень по-разному переносят фиксацию - была одна GFP+ перевиваемая лимфома, которая ВООБЩЕ ничем не убивалась, по-моему, но там такой силы был сигнал, что мне приходилось ND фильтр присобачивать к 525/15. А вот последний мой GFP был как та примадонна - криво посмотришь и он все, чпок. 

(Reply to this) (Parent) (Thread)

У нас GFP-Foxp3, их и так там писюн положительных в мышке, так после фиксации GFP пропадал больше чем на 50%. Протокол настрочила. :)

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Я тебе писала из горящего танка, в смысле за десять минут до того, как идти вести трехчасовой семинар про проточку :) и умотала в лабу :) вот пришла домой и сейчас буду читать!

АААА, и поздравляю-поздравляю-поздравляю с удачной отправкой 30 кг!

(Reply to this) (Parent) (Thread)

:) Спасиб

(Reply to this) (Parent)

Ура, меня понимают!! Я на тебя очень надеялась.
Давай, присылай мне что у тебя входит в набор окраски вместе с GFP. От этого протокол будет меняться чуток, я детали поясню.
Секрет на CXCR5, как ты можешь догадаться, с ним тоже напрямую связан.

(Reply to this) (Parent)

Ты крута! Правда, наша биолог в лабе владеет только английским, я опухну пересказывать, да ещё и ошибусь в ста местах :))

(Reply to this) (Thread)

Если вы не работаете с GFP, то не надо мучаться, пожалуй. :)
А вот если работаете, то скажи ей, is it possible to fix GFP+ cells for flow? И услышь в ответ стенания, что это невозможно чисто технически.

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Ага :)) попробую.

(Reply to this) (Parent)

Я давно гордилась своими френдами - какие они у меня все талантливые и замечательные.
Но ты просто гений! Горжусь втройне.

(Reply to this) (Thread)

Гений - это все-таки для людей явно поумней.
А я технический трублешутер. Но крутой, похоже, чо. :))

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Срочно создавать создавать продукт, а то сейчас есть позиция ученого, а завтра нету, а так есть план Б и вероятно свой маленький свечной заводик. В Швеции немало профессоров так себе на интересную жизнь заработали.

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Увы, свечной заводик мне не грозит. Я чужие готовые реагенты использую, просто чуток необычно. ;)

(Reply to this) (Parent)

(заинтересованно) что, alexa488 поверх прокрашиваете?

(Reply to this) (Thread)

Нет, GFP удалось родной сохранить, без усиления чем-либо вторым этапом. :)

(Reply to this) (Parent)

Хм, а почему они (лекторы на воркшопах) такое заявляли? Известно же, что если у тебя флюоресцентный белок в цитозоле, то высока вероятность похерить все фиксацией/пермеабилизацией метанолом (этанолом) в морозильнике, иногда просто вымывает нафиг все, а остается только что-то вменяемое при локализации белка в мембране. "Необычная" фиксация трихлоруксуской обычно спасает в таких особо запущеных случаях.

Да, если ваш протокол действительно работает универсально, то стоит его коммерциализировать. Иначе, все равно, рано или поздно ваш подход чуток модифицируют и тогда опять покупать продукт у "дяди", а так вы сами имеете шанс стать буратинкой с недеревянными мозгами и шансом работать на себя :).

(Reply to this) (Thread)

Да мой протокол не включает в себя ничего уникального, кроме как видоизменение протоколов на коммерческие киты для фиксации. Тут нечего коммерциализировать, совсем. :)
А фиксация нужна для FOXP3. Он внутриядерный, так что "легкие" или необычные способы фиксации, при которых есть шанс сохранить GFP, не прокатывают.

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Это называется инновация процессинга, но вы правы, свечной заводик, увы, пока не грозит, пока.... может вы завтра что-то еще придумаете :)

(Reply to this) (Parent)

А фиксировать то зачем? CXCR-ки надобно сразу мерять

(Reply to this) (Thread)

Ну не всегда то что надо в реальности совпадает с тем что надо по плану. :))

(Reply to this) (Parent) (Thread)

C CCR и CXCR еще один трабл- на замороженных- размороженных семплах многие не поймаешь (как, к примеру CCR7 для naive/memory subsetting)

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Как недавно (мной) выяснилось, все эти маркеры надо колупать индивидуально. Например, CCR7 отлично красится и на замороженных, если они более-менее живые. Но надо делать инкубацию 30 минут при 37 градусах внутри инкубатора (чтоб и CO2 к ним приходил). Попробуйте - будет отлично. И на человеческих, и на мышиных.
CXCR5 напротив этого не переносит категорически.
Если у вас размороженные клетки дают много грязи и дохляка - обращайтесь. :) Научу морозить и размораживать так, что и пять лет спустя в жидком азоте ни viability, ни фенотип, ни деления в течение 4 дней не отличаются от свежих.

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Ну не отличаются, но нейтрофилы все конечно же сдохнут и исчезнут. Остальные - нет

(Reply to this) (Parent)

Да все с ними ок, с этими материалами я лет 15 работаю, как и с флоу.
Но "свежачок" все-таки- релевантнее всего.

(Reply to this) (Parent)

PD-1 коэкспрессия, ага :)

(Reply to this) (Thread)

Ну у меня еще там Foxp3 и BCL6, оба только внутри. PD1 нормально superficial ловится.

(Reply to this) (Parent)

А флоу в "глянцах" весьма часто выглядит, как shit...Ибо деды-ревьюеры, в основном, в современных методах не понимают.

(Reply to this) (Thread)

Вот! Наконец-то я эту фразу вижу от кого-то еще. :)
А то ей богу, я говорю что оно shit, а на меня все смотрят косо - мол, PNAS же. Блин. И я тот же аргумент использую - мол, ну а кто красил-то, сам ОН, что ли? Нифига, технишен или студент. А потом послали на ревью тем, кто сам цитометрию в жизни ни разу не гонял.

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Именно так все и происходит.
Красивая цитометрия в Nature Imm бывает только от Марио

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Я знаю Марио только того что с усами и прыгает хорошо. :)

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Неее, другой.

http://www.niaid.nih.gov/labsandresources/labs/aboutlabs/vrc/immunotechnologylaboratory/Pages/roederer-immuno.aspx

(Reply to this) (Parent)

Roederer :)

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Ja ja!
Классный чувак.

(Reply to this) (Parent)

статью напиши.

(Reply to this) (Thread)

Да нечего там, это ж просто решение технической задачки. :)

(Reply to this) (Parent)

Публикуйся, бабка!
Публикуйся, любка!
Публикуйся, ты моя
Сизая голубка!

:-)

(Reply to this) (Thread)

10 баллов ))

(Reply to this) (Parent)

Да нечего там. Просто траблшутинг. Разве что из самой окраски что-то получится. ;)

(Reply to this) (Parent)

Вспоминается "Женитьба Бальзаминова": "Добрая-добрая!"

Снимаю шляпу, чё.

И перед добротой - тоже.

(Reply to this) (Thread)

Дык все равно в ЖЖ это мало кому надо ;))

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Ну, судя по камментам, "в теме" чуть больше, чем никто ))

(Кстати, польщен. Велкам))).

(Reply to this) (Parent)

Добрый день! Да, страстно хотела бы узнать секрет. Я крашу клетки для флуоресцентной микроскопии, клетки прикрепленные, распластанные, смешанные культуры клеток, экспрессирующих GFP и mKate2. mKate2 диффузный, GFP диффузный или сшитый с белком межклеточных адгезионных контактов Е-кадгерином.

При фиксации 3,7% параформальдегидом диффузные GFP и mKate видны хорошо, но препараты нестабильны, через пару недель флуоресценция расплывается. После пермеабилизации тритоном х-100 (0,5% 5 минут) или при фиксации метанол:ацетон 1:1 15 минут флуоресценция пропадает. Пермеабилизация принципиальна при параллельной окраске антителами (на фокальные контакты, кортактин, Е-кадгерин) или фаллоидином.

GFP красится прекрасно антителами Millipore AB3080P (кролик) и Rockland 600-301-215 (мышь) после фиксации параформальдегид +тритон. После метанол-ацетона не красится. Millipore AB16901 (курица) не красит совсем после фиксации согласно протоколу (вариация параформальдегид+тритон).

Буду очень признательна, если поделитесь ноу-хау. Очень нужна и нативная флуоресценция, и любые возможные варианты фиксации под куриные антитела.

(Reply to this) (Thread)

ОК, вечером напишу в личку. Только вот проблема - у меня протокол-то этот на цитометрию заточен. Может не сработать на микроскопию.

(Reply to this) (Parent)

abcam ab13970 GFP (chicken) работают прекрасно на тканях фиксированных 4% pfa. красили на вентане, лейке и ручками. нативный мы не рассматриваем, потому что это почти артефакт после фиксации. для лучшего эффекта стоит использовать alexa-ХХХ от invitrogen в конфигурации, подходящей к вашей системе определения (мы используем биотинилированные вторичные и tyramide-alexa-xxx)
ну и на всяк случай, e-cadherin антитела - BD Transduction #610181
(если что, красим до 4 антител последовательно)

таня, можно и мне секреты мастерства, я их врагу не продам, но попробую на тканях тож.
в ответ, могу помогать с антителами, что работают для гистохимии (автоматической, правда).
еще могу добавить по вопросу коммерциализации. это непросто, но если потрахаться (а у вас с этим - легко ;)), то можно придумать "кит", который будет включать известные всем реагенты, расфасованные в баночки "reagent a", "reagent b" etc и сопровожденные соответствующим протоколом. именно так барыги из компаний и коммерциализируют свои фокусы. там нет rocket science, а просто смекалка. помочь вам сможет ваш office of technology development
и еще могу поделится страшным секретом приготовления cell pellets для гистохимии

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Да я как раз и использую баночки "реагент А и В", увы. :)
cell pellets для гистохимии хочу! Я умею делать 2 путями: на специальной центрифуге цитоспин (если у меня клеток много), и олдскульные мазки недрогнувшей рукой (если клеток кот наплакал). Получается прилично, если цитоспин не плюнет мимо лунки клетками, что иногда бывает. В мазках, которые я потом просто на воздухе сушу, иногда проблема с тем, что клетки при мытье отрываются и покидают меня, а их и так мало.
Поэтому очень хочу другие способы. Особенно чтоб надежно и бережно прикрепить писюн например тысяч в пять-десять лимфоцитов.
Протокол послала личкой.

(Reply to this) (Parent) (Thread)

получил, спасибо.
сижу, втыкаю... дело осложняется тем, что непонятно, что в составе буферов. погляжу мсдс, поговорю с умными людьми.
фишка, в нашем случае, в том, что мы страшно не любим мороженные ткани. минимум - фиксированные и мороженные, идеально - фиксированные и парафин. так что для нас этот протокол сработает только в случаях упорства или ошибок. покраска с анти-GFP идет отлично на любых тканях, а учитывая, что только правильно сделанные парафиновые срезы дают прекрасную картинку (морфология и качество), видимо так и будем. про cell pellets сейчас в личку кину.

(Reply to this) (Parent)

Вот в комменте ниже Кермит дает правильный совет, что бы я пыталась сделать в этом случае. Все-таки микроскопия менее чувствительна, чем цитометрия, и если я вижу подсевший, но все еще существующий GFP на цитометре, то не факт, что он же будет виден под микроскопом.

(Reply to this) (Parent)

Написала в личку.

(Reply to this) (Parent)