ужас! с какого ж момента это будет? а вот фигушки! смотри. я статью про фактры транскрипции в украиноязычную википедию написала, так что я теперь и сама разобралась. Вот клетка. Вот внешний сигнал. Ответ на сигнал начинается с с момента распознавания его внешними рецепторами на клетке. Дальше идет передача сигнала по цепи. Экспрессия транскрипционного фактора это фактически последниее звено передачи сигнала . Включается фактор транскрипции и запускает весь каскад экспрессии генов, которые обслуживают ответ на этот сигнал (деление клетки в данном случае). Теперь поди разберись, что ты подразумеваешь под ответом на натурально именно собственно воздействие? Что меня напрягло в твоей истории это видимое отсутствие контроля. Я думаю, что он есть, просто ты его не упомянула.

(Reply to this) (Thread)

мРНК не может появиться ДО того, как сигнал от рецептора дошел до ядра, сотворил все нужные дела, верно? Они, эти мРНК, появляются через 6 часов. Вот, например, экспрессия FOXP3, он меня больше всего и интересует, через эти 6 часов уже есть, это описано. Значит, через 6 часов он должен начать работать. И учитывая что длительность клеточного цикла у нормальных лимфоцитов 15 часов в среднем, через 24 часа всяко должен быть уже первый пик деления и первая разница в делении между контролем и опытом. Вот в этом пункте и не сходится: от момента посадки проходит 24 часа (на первый пик), плюс еще 48 часов. И это уже должно быть три цикла деления по всякому плюс к первому циклу. То есть 4 пика деления минимум, всего. Я ж вижу 2-3 пика деления всего, через 72 часа от момента посадки. Ломаю голову - почему не сходится. Задержка, значит, какая-то.
Плюс контроли - просто стимуляция деления. Сам опыт - с той же стимуляцией плюс еще и вещества, стимулирующие экспрессию FOXP3. Минус контроль - не стимулируем деление, они и не делятся ни разу.
Смотрим разницу между пиками делений без стимуляции FOXP3 и со стимуляцией. И учитывая что вроде как есть задержка по времени, что они не делятся как рассчитывается по теории, у меня и вылезает подозрение, что может не надо анализировать первые пик деления, отбрасывать его? Или даже отбрасывать первый и второй пик?
То есть приходит умный человек и говорит мне: Таня, ты дура, лимфоциты после выделения из крови и посадку в плашку первые сутки вообще ничего не слышат от шока, никаких сигналов не принимают и они не работают. Я говорю - о, спасибо, и вопрос решается. ;)) Только я продолжаю недоумевать, какого ж черта тогда мРНК FOXP3 через 6 часов уже взлетает в уровне.
Как-то я совсем тупо объяснила, да? :(

(Reply to this) (Parent) (Thread)

ну я пробую разобраться. скажи, а до момента стимуляции вы их как-то в фазах синхронизируете? вот вы выделили лимфоциты. они ж все в разных фазах вроде, да? теперь простимулировали. в принципе сигнал воспринят, передан до ядра, врубилась экспрессия, ждем деление. пральна? но они ж изначально вразброд гуляли, да? Я сейчас поставлю свою РННКушечку на синтез сДНК и подумаю, что тут у тебя не так. интересно ж.

(Reply to this) (Parent) (Thread)

А ты знаешь, синхронизировать их не нужно. Ведь как работает CFSE метка: она при делении помеченной клетки делится между дочерними ровно пополам. Итого - в первом поколении клеток снижается интенсивность свечения CFSE ровно в 2 раза. Во втором поколении - свечение ниже ровно в 4 раза. И на графике ты видишь: самый интенсивный пик это клетки, оставившие внутри себя всю метку, а значит неделящиеся. Пик вдвое меньшей интенсиности - это все, кто поделился один раз. И так далее. То есть без всякой синхронизации, просто из-за особенности метки, все клетки ты видишь в виде пиков свечения. С другой стороны почему не нужна синхронизация: в крови здорового человека по умолчанию все лимфоциты (99,9%) находятся в покоящейся фазе клеточного цикла. И входят в цикл лишь после стимуляции. То есть теоретически, учитывая что они одинаковые, они и в цикл после неспецифической стимуляции должны входить как зайки, одинаково и одновременно.
Вот поэтому я и думаю, что вразнобоя не должно быть. Сказали им - вот, стимуляция. 6 часов - видим что экспрессия врубилась, верно? Цикл посчитан до нас, 15 часов в среднем. Но см выше, тормозят. То есть где-то собака порылась, а я не соображу пока, где.
Есть такая идея: что поскольку клетки несчастны и в шоке после всех манипуляций, может они сигнал слышат, вот отвечают своим синтезом мРНК, но потом в какой-то фазе цикла задерживаются, пока в себя не придут? Или вторая, противоположная идея: сразу после выделения до них еще не дошло, что стряслась какая-то жопа и что они уже в презервативе (зачеркнуто) в плашке, и они начинают ответ как обычно в организме, то есть быстренько. Потом смотрят - а вокруг темно и страшно. И зависают.
Или я просто тормоз и ответ прост, что после активации факторов транскрипции до их срабатывания на уровне уже деления всей активированной взрослой клетки проходит время, бОльшее чем один клеточный цикл.. тоже ерунда.
Ты только время не трать на меня всерьез, ладно? Я так, подумала просто что вдруг это для меня ВОПРОС, а кому-то это прописная истина. ;))
Пишу с работы, не логинюсь тут. tanchik

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Да я не трачу. Просто интересно поспекулировать на чужих результатах, правильно?
Таня. Я тебе вот что скажу. От синтеза мРНК до функционального белка, который обслуживает клеточный цикл - пропасть. Дело даже не только в синтезе белка, играет роль все, кислотность и фазы луны. Более того, в хоровод по обслуживанию деления столько путей сходится. Может там два пути не контактируют вовремя, вот и задержка.
Во-вторых, и это важно вообще. Нам тут недавно занимательные результаты показали. Сделали принципл компонтент анализ всех результатов из биочипов растительных. Просто так вот все в один котел сбросили, нажали кнопочку и посчитали. И знаешь что получилось? Все результаты на материалах инвитро, независимо от того, что анализировали, упали в один кластер. Что говорит только об одном: ткани в инвитро ведут себя принципиально отлично от тех самых тканей в организме. Не выпускай этот факт из головы.

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Хех, последний пример меня не-по детски прямо впечатлил. :) Ну то есть нытики бы из этого сделали бы вывод, что нафига тогда вообще все это инвитро надо, но мы не из их числа.
Насчет своего вопроса поняла, упрощать не буду. ;) Хрен с ними, раз неизвестностей больше чем известного, поможет весьма прогрессивный метод научного тыка. Тыкну их как-нибудь при случае в разные по времени моменты. ;)))
Спасибо!
tanchik

(Reply to this) (Parent)

Блин, как у вас всё интересно. Хочу к вам. :)

(Reply to this) (Parent)

я к чему про контроль сказала. только что получили на ревью статью китайцев. они брали растеньица грушки инвитро, подвергали их стрессу, собирали материал через час, два, пять, десять, двадцать четыре и смотрели экспрессию скажем гена Х. как контроль они взяли нестресованое растение. на первый взгляд все ок. НО! за эти час, два, пять и десять часов нестресованое растение грушки тоже растет. отвечает например на циркадные ритмы. может эти гены на день-ночь отвечают, почем мы знаем? корректный дизайн эксперимента должен выглядеть таким образом, когда через эти промежутки времени сравнивают стресованые и нестресованые растения.

как это делается с отдельными лимфоцитами, черт его знает.

(Reply to this) (Thread)

Ну бедные лимфоциты, когда их вынули из сосуда, долго трахали в центрифуге и изолировали, всяко в стрессе, что контроль, что основные. То есть по условиям стресса группы одинаковы. ;)) Я вот выше пыталась пояснить суть эксперимента и что меня смущает. Кратко: какого фига они характерные мРНК выдают аки зайки через 6 часов стимуляции, а делятся не через положенные пусть даже эти шесть часов плюс свой цикл 15 часов, а намного медленее? Что они там гады, в лунках, оставшееся время делают? ;))

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Tania,
srazu ogovorus', chto s lymphocitami ne rabotala, no reshila vse-taki napisat' - mojet, eto budet dlia vas polezno. Naskol'ko ia poniala, vashi dannye ne shodiatsia s literaturnymi: vashi lymphocytes prohodiat 2-3 cikla, za to je vremia, chto "literatyrnye" prohodiat 4. V toje vremia FOXP3 mRNA poiavliaetsia cherez 6h i po vashim dannym, i po literaturnym. Na moi vzgliad otstavanie na 1-2 cycles bol'shogo znacheniia ne imeet; ia by v takom sluchae orietirovalas' na svoi dannye, a imenno (ponimaiu, chto vy prosili eto ne predlagat'!) izuchila by, kletochnyi cikl svoih kletok i rabotala by dal'she na osnovanie etih dannyh. Pust' vash kletki prohodit cikl za 20 h, a ne za 15 h. Togda 3 cycles vashih kletok ravny po vremeni 4 cycles "literaturnyh" kletok. Ili je, kak vy predpolagaete, vashim kletkam nujno vremia na adaptaciiu v nachale. Ia by vse je postaralas' s etom razobrat'sia sama (ponimaiu, chto, vozmojno, ne hochetsia tratit' denigi i vremia). Eshe vy pishite pro expression FOXP3, no otdel'nyi vopros, po-moemu, ego voobshe zdes' rassmatrivat' ne nado. Naskol'ko ia poniala, vy tol'ko znaete, chto FOXP3 expressiruetsia i v vashih kletkah i v "literaturnyh" cherez 6 chasov, a nado sravnivat' kinetiku expressii FOXP3 (cherez skol'ko chasov on poiavilsia? kogda expressiia dostigla pika? i t. d), u vas takih dannyh net; krome togo ih trudno po PCR poluchit' dostoverno.
Hope this helps,
Anna

(Reply to this) (Parent) (Thread)

А я вот только-только статью прочитала, что через 24 часа уже у других людей у лимфоцитов в тех же условиях развивался ответ, они тестили через 24, 48 и 72 часа, то есть именно этот опыт и сделали, зайки. ;))
А я теперь пожну их плоды. Хехе!

(Reply to this) (Parent) (Thread)

Good luck

(Reply to this) (Parent)

тань поройся, до эпохи сд была такая штука как теофилин чуствительность. были статьи по стимуляции тимогеном. по идее у тех кто ставил методики должны быть такие данные, ведь основывали они же на чем то сроки учета? Журнал кажется "Лабораторное дело" годы примерно 70.

(Reply to this) (Thread)

Рылась уже, ага. В том числе и в статьях более новых, но одно и то же: они редиски стимулировали чем угодно и собирали клетки потом через 24, 48 и 72 часа. И ни одна сво не смотрела, через сколько ж самое раннее собирать надо, просто ждали день-два-три и смотрели разницу. У меня такое не прокатывает, мне надо нащупать точку во времени, когда клетка начинает отвечать..

(Reply to this) (Parent) (Thread)

а на чем основывали что именно 24? от балды???.... смотри наоборот ранние работы, не тогда когда метода вовсю уже юзалась и эти сроки большинсво принимало как данность, а тогда когда разрабатывалась.

(Reply to this) (Parent)

Так в какое время от начала эксперимента оказываются пики делений? Если их три, то между вторым и третьим - действительно те 15 часов, или больше?

(Reply to this) (Thread)

Я не знаю, в какое время от начала эксперимента клетки начинают делиться и не знаю расстояние по времени между пиками. Именно это я и хотела узнать (в том числе и это). Из литературы прочитала, что у нормальных лимфоцитов инвитро клеточный цикл после активации длится в среднем 15 часов. У меня нормальные, инвитро, после активации. Не сходится. Спросила.

(Reply to this) (Parent)

В молбиол на форум не хочешь написать?

(Reply to this) (Thread)

Неа, очень долго объяснять придется, чем я занимаюсь и почему. ;))
tanchik

(Reply to this) (Parent)

про cfse коротко: дней пять-шесть с pha. это навскидку и для т клеток. в пятницу можно перетереть дтальнее. кроме того, способности клеток делиться разные и красиво выходит не всегда.

(Reply to this) (Thread)

У меня красиво выходит почти всегда, а если не выходит, то опыт считается неудачным, результаты выкидываются, а сам он переделывается. ;)
Суть вопроса заключается в двух вещах:
- каково обычно минимальное время от посадки до первого пика деления? Оно не совпадает с рассчетным, а получается больше.
- Почему количество делений не совпадает с рассчетным, учитывая что клеточный цикл лимфоцитов как раз инвитро около 15 часов.
А пять дней мне нафиг не нужны, трех дней хватает вполне и наоборот хочу сократить время эксперимента. Для чего мне нужно разобраться в вопросах один и два. ;)

(Reply to this) (Parent) (Thread)

ответ на эти вопросы - только в твоих руках. ты можешь прочитать всю литературу на свете, а работать будет так, как работает.
вообще, как референс, порекомендую (если ты вдруг еще не) иметь закладки на тематических current protocols in xxx (где ххх - иммунология, мол и клеточная биология и т.п.)
открой на работе, поинтересуйся:
http://www3.interscience.wiley.com/browse/?type=CURRENT_PROTOCOL
что же до "сигналинга", то если твоя задача поймать сигнал (а в этом я сомневаюсь), то сигнал будет через несколько минут. вот только от сигнала до РНКи и тем более до деления довольно длинный и не всегда результативный путь. поэтому крутые пацаны, когда доказывают процесс показывают все от сигнала, до РНК и в конце концов протеина. потому как если есть все, кроме протеина, то историей можно жопу подтереть.

(Reply to this) (Parent) (Thread)

По поводу сигнала нашла я все-таки аналогичные статьи. Именно вот задержку поясняющие. ;)
А за ссылку спасибо!

(Reply to this) (Parent) (Thread)

ссылка да, хорошая, но там общие принципы и методы. они работают, но могут отставать от текущего момента (немного) и не иметь мелких удобных фишек.
другое дело, что мелкие фишки люди обычно и в статьи не вставляют. особенно в highly competitive areas. т.е. ты вроде бы делаешь, как написано, а получается не совсем так. это не значит, что у тебя руки не из плечей. стоит прямо написать авторам и спросить. может много интересного выясниться, особенно если статья из группы друзей босса или коллабораторов :)

(Reply to this) (Parent)

"где рыться мне"
pubmed.
medline (елси есть подписка)

(Reply to this) (Thread)

Гуглить я умею, и Пабмед наше все. :)Только вот там не бывает статей "сравнительное изучение начала деления лимфоцитов, скорости этого деления и задержки после выделения их из крови". Это все-таки сугубо технический вопрос.

(Reply to this) (Parent)